http://jpet.aspetjournals.org/content/308/1/394.full

In Vitro Discrimination of Fluoroquinolones Toxicity on Tendon Cells: Involvement of Oxidative Stress

1. F. Pouzaud,
2. K. Bernard-Beaubois,
3. M. Thevenin,
4. J.-M. Warnet,
5. G. Hayem and
6. P. Rat

+ Author Affiliations

1. Laboratoratoire de Toxicologie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université Paris, Paris, France (F.P., M.T., J.-M.W., P.R.); Unité de Pharmaco-Toxicologie, XV/XX Centre Hospitalier National d'Ophtalmologie, Paris, France (F.P., K.B.-B., J.-M.W., P.R.); and Departement de Rhumatologie, CHU Bichat-Claude Bernard, Paris, France (G.H.)

1. Address correspondence to:
   Dr. Patrice Rat, Laboratoire de Toxicologie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université René Descartes Paris5, 4 Av de l'Observatoire, 75270 Paris cedex 06, France. E-mail: warnet@pharmacie.univ-paris5.fr

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Abstract

Tendinopathy are classic side effects observed with fluoroquinolones antibiotics. A previously validated model based on a spontaneously immortalized rabbit tendon cell line (Teno cell line) was used to evaluate cellular responses to the fluoroquinolones pefloxacin (PEF), ofloxacin (OFX), levofloxacin (LVX), and ciprofloxacin (CIP), in various concentrations. Cell viability, redox status changes, reduced glutathione content, and reactive oxygen species production were assessed using neutral red, Alamar blue, monobromobimane and 2,7-dichlorofluorescindiacetate fluorescent probes, respectively. Living adherent tenocytes were analyzed using a cold light cytofluorometer adapted to 96-well microplates. All fluoroquinolones showed moderate cytotoxicity after 24 h and more severe, significant toxicity after 72 h on tendon cells. Moreover, two groups of fluoroquinolones may be differentiated: intrinsic toxicity for tendon cells was high with ciprofloxacin and pefloxacin [redox status decrease was 80 and 62% (^*p < 0.05) for PEF and CIP at 1 mM for 72 h, respectively], but moderate with ofloxacin and levofloxacin LVX [redox status decrease was 30 and 22% (^*p < 0.05) for OFX and LVX at 1 mM during 72 h, respectively]. Our model supports a role for early oxidative stress in the development of fluoroquinolone-induced tendinopathy. Moreover, our study indicates that intrinsic toxicity to tendon cells varies across fluoroquinolones. The Teno cell line may be a useful model for detecting and evaluating tendon toxicity of new fluoroquinolones and other drugs associated with tendinopathy.

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Fluoroquinolones antimicrobial agents are widely used in clinical practice as broad-spectrum antimicrobials with excellent bioavailability. However, they have been reported to induce tendinopathies and, less often, arthralgia and myalgia (Jorgensen et al., 1991; Hayem and Carbon, 1995; Stahlmann and Lode, 2000; Stahlmann, 2002). The main target is the Achilles tendon, where complete rupture can occur; other sites of involvement include the shoulders, knees, hand, and plantar fascia. More than 400 cases of FQ-induced tendinopathy have been reported (Ribard et al., 1992; Zabraniecki et al., 1996; Lewis et al., 1999; Van Der Linden et al., 2001).

Risk factors for fluoroquinolones-induced tendinopathy include older age, corticosteroid therapy and renal dysfunction. Achilles cause prolonged functional impairment. This pathology can be observed in patients only a few hours or days after receiving a single oral dose of FQ, and results in a serious source of invalidity (Stahlmann and Lode, 2000).

The mechanisms underlying fluoroquinolone-induced tendinopathy remain incompletely understood, and the absence of an animal model has been an obstacle to their elucidation. Several studies have investigated fluoroquinolone toxicity for joint tissues using either flow cytometry (Hayem et al., 1994, 1996; Ratinaud and Valet, 1994; Thuong-Guyot et al., 1994) or histology (Kato et al., 1995; Kashida and Kato, 1997; Shakibaei and Stahlmann, 2001). However, these methods do not allow for the measurement of labile markers for oxidative stress and are not well suited to systematic toxicological screening. Microtitration cold light cytofluorometry that we developed (Rat, 1994; Rat et al., 1994, 1995, 1996, 1997) can be used to assess drug effects and to screen for toxicity (Rat et al., 1996) on living adherent cells without prior trypsination or dispersion. Therefore, it limits artifacts that might take place during monodispersion or extraction processes, which are often used in flow cytometry and biochemistry.

The aim of this study was to further assess the discrimination of intrinsic tenotoxicity potential of four fluoroquinolones: pefloxacin (PEF), ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LVX), and ofloxacin (OFX) using methods that comply with the recommendations issued by the European Center for the Validation of Alternative Methods (Clothier, 1989; Balls and Fentem, 1992). We used an immortalized rabbit-tendon cell line that express type I collagen. The cells were exposed for variable period to OFX, PEF, CIP, or LVX. Cell viability, redox status, reactive oxygen species, and intracellular reduced glutathione content were assessed using neutral red, Alamar blue, 2,7-dichlorofluorescin-diacetate (DCFH-DA), and monobromobimane probes, respectively. Such methodology allowed us to investigate the mechanism of fluoroquinolone tenotoxicity.

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Materials and Methods

Reagents Supply. PEF, LVX, and OFX were from Aventis (Strasbourg, France) and CIP was from Bayer AG (Wuppertal, Germany). Monobromobimane, Neutral Red, and DCFH-DA were purchased from Molecular Probes (Eugene, OR). Alamar blue was obtained from Interchim (Asnières, France). Dimethyl sulfoxide and ascorbate were obtained from Sigma-Aldrich (St-Quentin-Falavier, France). The culture medium (Ham's F-12), trypsin, and calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline (PBS) were purchased from Eurobio (Les Ulis, France). Fetal calf serum (FCS) came from Dominique Dutscher (Brumath, France).

Fluoroquinolone Stock Solutions. Fluoroquinolones stock solutions (10^-2 M) were prepared in HCl (0.05 N) and stored at 4°C. These solutions were diluted in Ham's F-12 medium containing 2.5% FCS to obtain concentrations ranging from 0.01 μM to 1 mM. Two cellular controls were used, namely, cells incubated with Ham's F-12 medium containing 2.5% FCS without xenobiotic (cellular control) and cells incubated with the highest HCl concentration used in the tested solution (vehicle control). No significant toxicity had been observed previously when tendon cells were exposed to the vehicle alone (0.005 N HCl).

Cell Culturing. In previous report, we cultured and characterized juvenile rabbit's tenocytes (Bernard-Beaubois et al., 1997, 1998). After this study, a spontaneously immortalized clone of tenocytes that we called Teno cell line was isolated from rabbit Achilles tendon. Cells were cultured in 75-cm² flasks containing Ham's F-12 medium supplemented with 10% FCS, 4 μg/ml gentamicin, 2 mM glutamin and incubated at 37°C in a moist atmosphere with 5% CO₂. The culture medium was changed every 2 days. Only cells expressing type I collagen from passages 88 to 92 were used.

Once a confluent cell layer was obtained, the medium was aspirated without disturbing the cell layer. The cell layer was washed once with warm sterile PBS, which was aspirated. Then, 1 ml of 0.25% trypsin was added to each 75-cm² flask, and the flasks were rocked gently to ensure that the cell layer was covered and that trypsin had penetrated between the cells. The flasks were replaced for a few minutes at 37°C in a 5% CO₂ atmosphere. The cells were viewed under a light microscope. The culture medium containing trypsin-inactivating factors was added to the flask. After centrifugation at room temperature, 700g for 3 min, the culture medium was removed and the cell pellets were resuspended in the medium, and then transferred into culture flasks. Finally, the cells were incubated at 37°C in a 5% CO₂ atmosphere. With the same cells culture medium, rabbit primary tenocytes have been obtained according to Bernard-Beaubois et al. (1997, 1998) protocols, rabbit fibroblast SIRC were obtained from American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC CCL-60).

Before microtitration analysis, cells were seeded into 96-well microplates (Costar-Dominique Dutscher, Brumath, France) with 5500 cells/well and kept at 37°C for 72 h. Finally, the cells were then exposed to one of the studied fluoroquinolones.

Light Microscopic Analysis. Rabbit primary tenocytes and Teno cell s were cultured in petri dishes containing Ham's F-12 medium supplemented with 10% FCS, 4 μg/ml gentamicin, and 2 mM glutamin. The dishes were incubated at 37°C in a moist atmosphere with 5% CO₂. The cultures were examined under a Leica inverted microscope (DMIR-B; Leica, Wetzlar, Germany).

RNA Extraction and Northern Blot Analysis of Rabbit Teno Cell Line, Primary Rabbit Tenocytes, and Rabbit Fibroblast (SIRC) Cells. Collagen I expression with and without ascorbate (50 and 100 μg/ml) was evaluate by Northern blotting. The steady-state level of mRNA encoding collagen I was measured by hybridizing the membranes with appropriate cDNA probes (Chomczynski and Sacchi, 1987; Mäkelä et al., 1988).

Total RNA was extracted from cells grown to confluence in standard medium according to the method of Chomczynski and Sacchi (1987) using RNAzolTM (Bioprobe, Montreuil sous Bois, France). Purified total RNA (12 μg) was electrophoresed overnight at 50 V in 1% agarose gel under denaturing conditions and transferred onto a `positive' nylon membrane (Appligène, Graffenstaten, France). The probes used for hybridization were the carboxy-propeptide domain of human α1(I) procollagen mRNAs (pH Cal 1U, 670 base pairs) (Mäkelä et al., 1988) and a mouse cDNA of 28S rRNA (4.7 kb) (Arnheim, 1979).

Inserts were prepared by restriction enzyme digestion of plasmids followed by electrophoresis and by purification from the agarose using Spin-X centrifuge filter units (Costar, Brunath, France) according to the manufacturer's instructions. DNA probes were labeled with [³²P]α-dCTP by random priming (Amersham, Saclay, France). Prehybridization (2 h) and hybridization (24 h) were performed at 65°C in 0.5 M sodium phosphate buffer (pH 7.2), containing 7% SDS, 2 mM EDTA, and 0.5 mg/ml herring sperm DNA.

After hybridization, the membranes were washed twice for 30 min in 40 mM phosphate buffer containing 1% SDS. The first washing was performed at 20°C and the second at 65°C. The filters were dried then exposed at -80°C to X-ray films (Kodak-X-OMAT AR or Hyperfilm; Amersham) with intensifying screens. Dehybridization was achieved by washing the filters at 80°C in 1% SDS for 1 to 2 h and was controlled by autoradiography of the stripped filters.

Cold Light Cytofluorometry. All fluorescence measures were performed using a highly sensitive (femtograms to picograms per milliliter) and specific cold light cytofluorometer (Fluorolite 1000-Dynex) (Rat et al., 1994). This apparatus used in combination with an extended photomultiplicator (280-900 nm) and a 100% photonic transmission in air enables highly sensitive detection with UV probes (5 pg/ml), green probes (femtograms to picograms per milliliter) and red probes (30 pg/ml). Moreover, cold light cytofluorometer is adapted to intracellular fluorescence analysis on living adherent cells in microplates that permit labile markers assessment.

Cell Incubation with Fluoroquinolones. After removal of the culture medium, the fluoroquinolones were added in various concentrations (0.01 μM, 0.1 μM, 1.0 μM, 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM; 200 μl/well). The microplates with the fluoroquinolones were incubated at 37°C in a moist atmosphere with 5% CO₂ for 24 h or 72 h.

Cell Viability Assay: Neutral Red Test. The neutral red assay is based on incorporation of the supravital dye neutral red into living cells. Neutral red stock solution (0.4%) was prepared in distilled water and stored at room temperature. Before staining, a fresh 1:80 dilution of the dye (50 μg/ml final concentration) in the medium was prepared. In accordance with the validated test of Borenfreund and Puerner (1984), 200 μl/well of medium containing neutral red were added to living cells, and the microplates were incubated at 37°C in moist atmosphere with 5% CO₂ for 3 h. Ethanol-acetic acid solution (200 μl/well) was added to reveal the fluorescent neutral red signal (Rat et al., 1994, 1995, 1996). The microplates were shaken for 15 min, and fluorescence was measured (excitation 535 nm/emission 600 nm) (Essig-Marcello and Van Burkirk, 1990; Rat et al., 1994).

Redox Status Assay: Alamar Blue Test. Alamar blue assay (De Fries and Mitsuhashi, 1995; Larson et al., 1997) uses a visible blue fluorogen probe resazurin, which is reduced to a red fluorescent compound (resorufin) by cellular redox enzymes. The Alamar blue solution, which is devoid of cytotoxicity, was added undiluted (20 μl) to the wells containing the fluoroquinolone solutions (200 μl), and the microplates were incubated at 37°C for 12 h. Intracellular fluorometric detection (excitation 535 nm/emission 600 nm) was performed using cold light cytofluorometry.

Reactive Oxygen Species Production Assay: DCFH-DA Test. ROS production was detected using the fluorogen DCFH-DA, which is activated by cellular esterases and reacts with cellular peroxidase to become a fluorescent product (Bass et al., 1983). Before fluoroquinolone treatment, DCFH-DA (20 μM/20 min) was added to each well containing the living adherent cells (Osseni et al., 1999). The fluorescence signal (excitation 485 nm/emission 535 nm), which is proportional to ROS production (Osseni et al., 1999), was measured using cold light cytofluorometry.

Reduced Glutathione Assay: Monobromobimane Test. Monobromobimane, which is an UV fluorogen bimane probe, reacts specifically with glutathione to form a fluorescent derivative (Kosower and Kosower, 1987; Han et al., 1997). The stock solution (16.6 mg/ml in 100% dimethyl sulfoxide), stored at 4°C, was diluted in Ca²⁺- and Mg²⁺-free PBS to obtain 100 μM monobromobimane. The diluted solution was added directly on the living cells in the microplates. Fifteen minutes later, fluorometric detection (excitation 390 nm/emission 480 nm) was performed using cold light cytofluorometry (Rat, 1994).

Expression of Results and Statistical Analysis. Each drug concentration was tested in different independent experiments to obtain minimum 12 single values for each concentration. All results were obtained in fluorescence arbitrary units and were then converted into percentages of the control value. Single-factor analysis of variance was performed with single values, followed by a bilateral Dunnett's test (Dunnett, 1955, 1964) at a level of significance of 0.05 (SigmaStat 2.03; SPSS Sciences, Chicago, IL).

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Results

Setting Up of the Teno Cell Line Model

The Teno cell line is one of the first tendon cell lines spontaneously immortalized from rabbit tendon cells that is usable for pharmacotoxicology study. Specific differentiation parameters of primary tenocytes such as morphology and collagen I expression have been assessed.

Morphology Control with Light Microscope Analysis. Rabbit primary tenocytes and Teno cell line exhibited a similar morphology. The cells were elongated cells and arranged in long chains (Fig. 1).

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Fig. 1.

The rabbit Teno cell line and primary rabbit tenocytes show similar morphological characteristics when viewed under an inverted light microscope. Primary rabbit tenocytes (X200) (A) and rabbit Teno cell line (200×) (B).

Collagen I Expression. Type I collagen transcripts were detected in primary tenocytes culture and in Teno cell line but not in rabbit fibroblast cell line (SIRC). Moreover, the amount of mRNA encoding collagen I protein increased in primary tenocytes and Teno cell line culture after treatment with 50 and 100 μg/ml ascorbate but not in rabbit fibroblast cell cultures (SIRC). Type I collagen mRNA was detected at passage 80, 90, and 92 of Teno cell cultures (Fig. 2).

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Fig. 2.

Top, Northern blot analysis (three experiments) of total RNA extracted from primary rabbit tenocyte, rabbit Teno cell line, and rabbit fibroblast (SIRC) incubated with or without ascorbate at different concentrations during 48 h. Equal amounts of total RNA (12 μg) were loaded in each lane and hybridized with a type I collagen cDNA probe. Sizes of type I collagen mRNA transcripts were 5.8 and 4.8 kb. Bottom, mouse cDNA of 28S rRNA (4.7 kb). A, primary rabbit tenocyte. B, rabbit Teno cell line P90. C, rabbit fibroblast cell line (SIRC). 1, cellular control 0 μg/ml ascorbate; 2, 50 μg/ml ascorbate; 3, 100 μg/ml ascorbate; α (1)I, Alpha 1 (type I) chain.

Fluoroquinolones Cytotoxicity

Cell Viability-Membrane Integrity Assessment: Neutral Red Test.Figure 3 shows the rate of cytotoxicity induced by fluoroquinolones. Cell viability was assessed with fluoroquinolones concentrations from 0.01 μM to 1.0 mM, a range that includes the therapeutic level in humans. After fluoroquinolones exposure of 24 h, a significant (^*p < 0.05) decrease in cell viability (^*p < 0.05) was seen only with the highest concentrations (1.0 mM) of PEF (58% versus control) and CIP (32.3% versus control). At this incubation time, the IC₅₀ (concentration associated with a 50% reduction of survival versus control) was approximately 1.0 mM for PEF and >1.0 mM for the other fluoroquinolones. Moreover, significant (^*p < 0.05) delayed tendon toxicity was detected after 72 h (Fig. 4), being the most marked with the highest concentration (1.0 mM) of fluoroquinolones. At 72 h, the IC₅₀ values were about 1.0 mM for PEF and CIP, and >1.0 mM for OFX, and viability showed significant (^*p < 0.05) decreases of 64.7, 43, and 16.5% with these drugs, respectively, compared with the cellular control; no significant difference in cell viability was found between LVX and the control.

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Fig. 3.

Cell viability evaluated after 24 h of continuous exposure of cells to fluoroquinolones. Cell viability was evaluated with neutral red probe directly on living tendon cells. Specific fluorometric detection of neutral red was performed with cold light fluorometry (excitation 535 nm/emission 600 nm). Values are mean percentage of control ± S.D. from two independent experiments in sixplicate (n = 12) (*, p < 0.05).

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Fig. 4.

Cell viability evaluated after 72 h of continuous exposure of cells to fluoroquinolones. Cell viability was evaluated with neutral red probe directly on living tendon cells. The specific fluorometric detection of neutral red was performed with cold light fluorometry (excitation 535 nm/emission 600 nm). Values are mean percentage of control ± S.D. from two independent experiments in sixplicate (n = 12) (*, p < 0.05).

Fluoroquinolones Induced Oxidative Stress

Redox Status Assay: Alamar Blue Test. At 24 h (Fig. 5), a significant (^*p < 0.05) decrease in redox status was found with the four fluoroquinolones only at high concentrations (0.1-1.0 mM). With PEF, a significant (^*p < 0.05) fall in redox status occurred with all concentrations. With CIP at concentrations of 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, redox status decreased significantly (^*p < 0.05), by 6.1, 10, and 31.7%, respectively. With OFX, significant (^*p < 0.05) redox status decrease of 3.4, 4.7, 9.5m and 26.2% occurred with concentrations of 1.0 μM, 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, respectively. With LVX in concentrations of 0.1 mM and 1.0 mM, redox status decreased significantly (^*p < 0.05), by 5.2 and 19%, respectively.

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Fig. 5.

Intracellular redox potential evaluated after 24 h of continuous exposure of cells to fluoroquinolones. Intracellular redox potential was evaluated with Alamar blue probe directly on living tendon cells. The specific fluorometric detection of Alamar blue was performed with cold light fluorometry (excitation 535 nm/emission 600 nm). Values are mean percentage of control ± S.D. from two independent experiments in sixplicate (n = 12) (*, p < 0.05).

After 72 h of incubation (Fig. 6), with PEF in concentrations of 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, redox status fell significantly (^*p < 0.05), by 6.4, 6.4, and 80.1%, respectively. With CIP, redox status decreased significantly (^*p < 0.05) with all concentrations studied. With OFX, significant (^*p < 0.05) decrease in redox status of 7.8, 6.6, 12.2, and 30.1% was seen with concentrations of 1.0 μM, 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, respectively. With LVX in concentrations of 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, redox status fell significantly (^*p < 0.05) by 6.7, 6.7, and 21.9%, respectively.

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Fig. 6.

Intracellular redox potential evaluated after 72 h of continuous exposure of cells to fluoroquinolones. Intracellular redox potential was evaluated with Alamar blue probe directly on living tendon cells. The specific fluorometric detection of Alamar blue was performed with cold light fluorometry (excitation 535 nm/emission 600 nm). Values are mean percentage of control ± S.D. from two independent experiments in sixplicate (n = 12) (*, p < 0.05).

Reactive Oxygen Species Production. As shown in Fig. 7, the tenocytes were incubated with a range of fluoroquinolones concentrations (0.01 μM-1.0 mM) for 45 min. At low concentrations (<10 data-blogger-escaped-and="" data-blogger-escaped-cip="" data-blogger-escaped-control="" data-blogger-escaped-different="" data-blogger-escaped-from="" data-blogger-escaped-lvx="" data-blogger-escaped-not="" data-blogger-escaped-production="" data-blogger-escaped-ros="" data-blogger-escaped-significant="" data-blogger-escaped-significantly="" data-blogger-escaped-sup="" data-blogger-escaped-the="" data-blogger-escaped-was="" data-blogger-escaped-whereas="" data-blogger-escaped-with="">*
p < 0.05) overproduction occurred with PEF (1.0 μM) and OFX (all concentrations). With high concentrations (10 μM-1.0 mM), a concentration-dependent increase in ROS production occurred with the four fluoroquinolones. With PEF, the increase was 33.9 and 207.4% at concentrations of 10 μM and 0.1 mM, respectively. With CIP, ROS production increased significantly (^*p < 0.05), by 18.6 and 192.4% at 0.1 mM. At 1.0 mM, ROS production was lower with PEF and CIP than with OFX and LVX.


Fig. 7.
Evaluation of the reactive oxygen species after continuous exposure of cells to pefloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, and levofloxacin (45 min). Reactive oxygen species were detected with fluorogen DCFH-DA probe. DCF fluorescence is proportional to reactive oxygen species production. The fluorometric detection of DCF was performed directly on living tendon cells with cold light fluorometry technology (excitation 485 nm/emission 535 nm). Values are mean percentage of control ± S.D. from two independent experiments in sixplicate (n = 12) (*, p < 0.05).
Moreover, ROS production increased significantly (^*p < 0.05) with OFX and LVX in therapeutic (10 μM) and supratherapeutic concentrations (0.1 mM and 1.0 mM). With OFX, significant (^*p < 0.05) ROS production occurred with all concentrations (13.7, 6.7, 8.4, 26.8, 155.6, and 173.5% with 0.01 μM, 0.1 μM, 1.0 μM, 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, respectively). With LVX, the increase in ROS production was 23, 161, and 164.1% with concentrations of 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM,
respectively.
Reduced Glutathione Assessment
This oxidative stress was correlated with glutathione depletion after 72 h (Fig. 8) of fluoroquinolone exposure. Significant (^*p < 0.05) decrease in glutathione content fell by 20.2, 20.2, 18.7, 26.1, 48.5, and 96.3% at 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, respectively. With CIP, glutathione content decreased by 16.3, 16.3, 13.7, 13.4, and 80.8% at concentrations of 0.01 μM, 0.1 μM, 1.0 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, respectively.



Fig. 8.
Intracellular glutathione content evaluation after continuous exposure to fluoroquinolones (72 h). Glutathione content was evaluated with monobromobimane fluorogen probe without extraction or fixation. The fluorometric detection of the probe was performed directly on living tendon cells with cold light fluorometry (excitation 390 nm/emissiom 480 nm). Values are mean percentage of control ± S.D. from two independent experiments in sixplicate (n = 12) (*, p < 0.05).
With OFX, the decrease in glutathione content was 16.6, 16.2, 15.8, 19.1, 32.7, and 45.5% with 0.01 μM, 0.1 μM, 1.0 μM, 10 μM, 0.1 mM, and 1.0 mM, respectively. With the same concentrations of LVX, glutathione content fell by 21.1, 22.9, 23.5, 19.6, 27.4, and 44.3%, respectively.
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Discussion
Although in vivo (Kato et al., 1995; Kashida and Kato, 1997; Shakibaei and Stahlmann, 2001) and in vitro (Kempka et al., 1996; Bernard-Beaubois et al., 1998; Williams et al., 2000) studies have investigated the potential mechanisms underlying fluoroquinolone-induced tendinopathy, no reproducible model has been proposed to detect and predict intrinsic fluoroquinolone tendon toxicity. Furthermore, most studies were performed directly on animals using biochemical and histological methods that do not allow for an accurate evaluation of oxidative stress, a factor that has been implicated in the development of fluoroquinolone tendinopathy (Kato et al., 1995; Kashida and Kato, 1997; Simonin et al., 2000). One of the main objectives of our study was to avoid the artifacts commonly generated by monodispersion or extraction procedures. Microtitration cold light cytofluorometry (Rat, 1994; Rat et al., 1994, 1995) detects labile markers of oxidative pathways and subjects the cells to only minimal mechanical or enzymatic stress.
Cellular Model Adapted to Tenotoxicity Discrimination. The morphology of Teno cell line was very similar to that of the primary tenocytes. The elongated cells were arranged in long chains, a pattern commonly reported for normal tenocytes (Ippolito et al., 1980; Bernard-Beaubois et al., 1997). Moreover, the rabbit Teno cell line but not rabbit fibroblast cell line expressed collagen I mRNA and clearly responded to ascorbate, which is known to enhance collagen I production (Kao et al., 1976; Schwarz and Bissell, 1977).
In our study, we used the Teno cell line to compare the intrinsic tendon toxicity of four fluoroquinolones. We found marked differences, with PEF and CIP exhibiting the highest toxicity at the concentrations seen in articular tissues, compared with OFX and LVX.
Tenotoxicity and Tissue Diffusion of Fluoroquinolones
FQ Cytotoxicity on Living Tendon Cell. Viability and redox status assays (neutral red and Alamar blue tests) showed alterations in membrane integrity and redox status, respectively, with the four fluoroquinolones after 24 h of exposure. Moreover, a significant delayed toxicity (72 h) occurred with PEF and CIP, compared with OFX and LVX. To provide a basis for extrapolating these results to clinical practice, we took into account the pharmacokinetic properties of the four fluoroquinolones tested in our study (Montay et al., 1984; Gonzalez and Hendwood, 1989; Stahlmann et al., 1995; Chien et al., 1997; Zhanel and Noreddin, 2001) (Table 1).
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TABLE 1
Pharmacokinetic properties of the four fluoroquinolones tested in our study
The range of concentrations tested (0.01 μM-1.0 mM) included the peak plasma concentrations seen in humans with the four fluoroquinolones tested (5.6-30 μM after a single oral dose of 500 mg) and the highest concentrations observed in articular tissue (Meissner et al., 1990; Yabe et al., 2001).
Recently, Yabe et al. (2001) reported that intraarticular OFX concentrations in juvenile dogs were approximately 1.8 to 2.0 times higher than the serum concentration 2 h after dosing. Similarly, Meissner et al. (1990) reported that halflife of OFX was longer in synovial tissues than in serum. OFX, PEF, and LVX diffuse more easily in tissues than does CIP, a fact that may contribute to the differences in tendon toxicity seen in clinical practice (Van Der Linden et al., 2001). Thus, comparison of these studies permits to conclude that FQ seems to penetrate well in articular tissues to an extent concentration higher than in serum. From the pharmacokinetics data, it can be deduced that OFX, PEF, and LVX are more diffusible than CIP and may explain that OFX, PEF, and LVX are more tenotoxic than CIP, as reported in clinic (Van Der Linden et al., 2001). The high intrinsic tenotoxicity of CIP observed in our study is limited in clinic due to low tissue diffusion. Moreover, up to now, it was difficult to classify LVX due to the lack of clinical observations. Our in vitro model permits to hypothesize that LVX has the same tenotoxicity in clinic as OFX. This hypothesis was suggested because of similar intrinsic tenotoxicity and similar tissular diffusion of OFX and LVX.
Fluoroquinolone-Induced Oxidative Stress and Glutathione Depletion. Because we were able to evaluate ROS production induced by direct fluoroquinolone exposure of living adherent tendon cells, our study provides the first strong evidence implicating ROS in fluoroquinolone tendon toxicity. Our methodological approach provides reliable and rapid detection of transient and labile markers such as ROS. In our study, all tested fluoroquinolones stimulated the ROS production, either at all tested concentrations or at the higher concentrations. After cellular exposition to high concentrations of PEF and CIP, a decrease in oxidative stress expression was observed probably due to highly mitochondrial alteration. A likely hypothesis is that the glutathione content falls rapidly so that intracellular antioxidant enzymes lose their ability to modulate the overproduction of ROS. Although intrinsic tendon toxicity is a class effect of fluoroquinolones, cell viability and glutathione content depletion distinguished two levels of toxicity: PEF and CIP were the most toxic, showing the most toxic effect on tendon cells, whereas OFX and LVX were moderately cytotoxic.
The present study strongly supports a role for oxidative stress among the mechanisms involved in fluoroquinolones-induced tendon toxicity, in keeping with earlier findings by Simonin et al. (2000). This hypothesis is in agreement with putative mechanisms of chondrotoxicity (Hayem et al., 1994, 1996; Ratinaud and Valet, 1994; Thuong-Guyot et al., 1994; Simonin et al., 2000). Hayem et al. (1994) documented mitochondrial alterations due to ROS overproduction in rabbit articular chondrocytes exposed to fluoroquinolones. In addition, both neutral red testing to evaluate cell viability/membrane integrity and Alamar blue assays to assess redox status provided evidence of cell membrane damage associate to necrosis. Cell death mechanism is directly dependent of fluoroquinolone concentrations. At high concentrations, we observed necrosis phenomenon. With low concentrations, an apoptosis mechanism could be suggested (chromatin condensation with DNA probe; data not shown). Of course, additional study should be realized to confirmed cell death mechanism.
ROS play multiple roles in health and disease. They have a direct toxic effect on cells and cellular components, serve as important messenger molecules in the induction of several genes, and act as second messengers in inflammatory processes. A Causal relationship has been demonstrated between intracellular ROS and induction of matrix metalloproteinases (Brenneissen and Puerner, 1997).
These data support the possibility that fluoroquinolone-induced ROS overproduction may activate matrix metalloproteinases, thereby contributing to damage the tendon microstructure. As suggested by Corps et al. (2002), matrix metalloproteinases expression can be selectively activated by fluoroquinolones in tendon cells. Another study (Williams et al., 2000) showed that fluoroquinolones increased proteolytic activity. This indirect enhancement of matrix metalloproteinases by fluoroquinolones might be ascribable to increased ROS production. The direct toxic effect of ROS on tendon cells and the indirect toxic effect mediated by enhancement of matrix metalloproteinases might act in synergy to cause fluoroquinolone-related tendinopathy.

It is the first time that oxidative stress mechanism was demonstrated in tenotoxicity induced by fluoroquinolones. Of course, additional in vitro study will be required to confirm the role played by ROS in the tenotoxicity of fluoroquinolones and to define whether ROS production was a limiting factor or just a component of the tenotoxicity.
Discrimination of Fluoroquinolone Intrinsic Tenotoxicity. Intrinsic toxicity of fluoroquinolones may not be the only mechanism underlying tendon rupture in patients treated with fluoroquinolones. The tissular diffusion of each fluoroquinolones, individual susceptibility, and other predisposing factors such as age, diet, end-stage renal failure, and corticotherapy should also be taken into account (Hayem and Carbon, 1995; Zabraniecki et al., 1996; Der Linden et al., 2001). This study demonstrates that intrinsic tendon toxicity varies across fluoroquinolones. After 72 h of exposure, we found evidence of marked tendon cytotoxicity with PEF and CIP and moderate tendon cytotoxicity with OFX and LVX. Our tendon cell model permit a reliable discrimination of fluoroquinolones intrinsic tenotoxicity using cellular markers such as membrane integrity, redox status, and reduce glutathione content.
In conclusion, the present study indicates involvement of oxidative stress in fluoroquinolone tendon toxicity and provides new insights into the underlying mechanisms. Our model using a tendon cell line and a microtitration technology based on specific fluorescent probes seems reliable for the toxicological screening of new fluoroquinolones, or other drugs believed to exhibit tendon toxicity.
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Acknowledgments
We thank Alexandre Staropoli for help in preparation of photographs.
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Footnotes
This work was financed by Adebiopharm (Paris) ER No. 67.
DOI: 10.1124/jpet.103.057984.

• ABBREVIATIONS: FQ, fluoroquinolones; PEF, pefloxacin; CIP, ciprofloxacin; LVX, levofloxacin; OFX, ofloxacin; DCFH-DA, 2,7-dihydrodichlorofluorescein diactetate; PBS, phosphate-buffered saline; FCS, fetal calf serum; kb, kilobase(s); ROS, reactive oxygen species.
• • Received July 31, 2003.
  • Accepted September 30, 2003.

• The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics

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1. Published online before print October 20, 2003, doi: 10.1124/jpet.103.057984 JPET January 2004 vol. 308 no. 1 394-402

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Fluor
Oxygène ← Fluor → Néon 9 F ↑ F ↓ Cl Tableau complet • Tableau étendu
Informations générales
Nom, symbole, numéro	Fluor, F, 9
Série chimique	halogène
Groupe, période, bloc	17 (VII), 2, p
Masse volumique	1,696 g·l-1 (0 °C, 1 atm), 1,50 g·cm-3 (liquide, -188,12 °C)1
Couleur	jaune verdâtre clair
No CAS	14762-94-8 2
Propriétés atomiques
Masse atomique	18,9984032 ± 0,0000005 u1
Rayon atomique (calc)	50 pm (42 pm)
Rayon de covalence	0,57 ± 0,03 Å 3
Rayon de van der Waals	135 pm4
Configuration électronique	[He] 2s2 2p5
Électrons par niveau d’énergie	2, 7
État(s) d’oxydation	-1
Oxyde	acide fort
Structure cristalline	cubique
Propriétés physiques
État ordinaire	gaz diamagnétique
Point de fusion	-219,67 °C (1 atm)1
Point d’ébullition	-188,12 °C (1 atm)1
Énergie de fusion	0,2552 kJ·mol-1
Énergie de vaporisation	3,2698 kJ·mol-1
Température critique	-129,02 °C
Volume molaire	22,404×10-3 m3·mol-1
Divers
Électronégativité (Pauling)	3,98
Chaleur massique	824 J·kg-1·K-1
Conductivité thermique	0,0279 W·m-1·K-1
Énergies d’ionisation5
1re : 17,4228 eV	2e : 34,9708 eV
3e : 62,7084 eV	4e : 87,1398 eV
5e : 114,2428 eV	6e : 157,1651 eV
7e : 185,186 eV	8e : 953,9112 eV
9e : 1 103,1176 eV
Isotopes les plus stables
Iso AN Période MD Ed PD MeV 17F {syn.} 64,49 s β+ ; ε 2,761 17O 18F {syn.} 1,8293 h β+ ; ε 1,656 18O 19F 100 % stable avec 10 neutrons 20F {syn.} 11,163 s β- 7,025 20Ne
Unités du SI & CNTP, sauf indication contraire.

Un tube contenant du fluor dans un bain de liquide cryogénique

Le fluor est un élément chimique de symbole F et de numéro atomique 9. Il s'agit du premier élément de la famille des halogènes, de masse atomique 19.
C’est l’élément chimique le plus réactif, d'ailleurs il a toujours été trouvé lié à d'autres éléments. Il possède la plus forte électronégativité, d'une valeur de 3,98. Il est le 13^e le plus abondant dans la croûte terrestre. Le seul isotope stable est ¹⁹F. L'autre isotope le moins instable est ¹⁸F et sa demi-vie est un peu moins de 2 heures. Dans ce cas, il se transforme ensuite en oxygène dans 97 % des cas par désintégration bêta et dans 3 % des cas par capture électronique.
Sa température de fusion est de -219 °C et sa température d'ébullition est de -188 °C, températures entre lesquelles le fluor est liquide, avec une masse volumique de 1 500 kg·m^-3. Aux conditions normales de température et de pression, le fluor se présente sous forme de difluor F₂, un gaz diatomique jaune pâle, très toxique et extrêmement corrosif. Le fluor provoque de très graves brûlures au contact de la peau, des muqueuses, et des os. Georgius Agricola décrivait déjà l'existence du fluor en 1530 mais cet élément n'a été isolé qu'en 1886 par Henri Moissan.

Sommaire 1 Histoire 1.1 Découvertes incomplètes 1.2 Recherches sur l'isolement du fluor 1.3 Travaux de Moissan 2 Propriétés physiques 2.1 Isotopes 2.2 Spectre 2.3 Combustion 2.4 Gaz 2.5 Plasma 2.6 Liquide 2.7 Superfluide 2.8 Solide 2.9 Composés 2.10 Minéraux 3 Préparation 4 Utilisation 5 Toxicité 6 Règlementation 7 Notes et références 8 Compléments 8.1 Bibliographie 8.2 Liens externes

Histoire

Le fluor (du latin fluere signifiant flux ou fondant) est d'abord mentionné au XVI^e siècle par Basilius Valentinus sous le nom de Flußspat puis décrit par Georgius Agricola en 1530, sous sa forme de fluorine, comme une substance utilisée pour promouvoir la fusion des métaux ou des minéraux⁶.

Découvertes incomplètes

Il a été dit que Heinrich Schwanhard utilisait de l’acide fluorhydrique pour graver le verre. Les premières explications du processus de formation de l’acide fluorhydrique furent publiées en 1725 par George Weygand, qui les tenait de Matthäus Pauli, qui lui-même les tenait d'un verrier anglais. En 1768, Andreas Marggraf décrivit la première observation de cette réaction chimique⁶.
Inspiré par les publications d'Andreas Marggraf, Carl Scheele commença dès 1771 à chercher la nature chimique du fluor, ainsi que le détails de ses réactions avec les acides. Il observa que le fluor attaquait le verre par des fumées obtenues en chauffant lentement un mélange de fluorine et d'acide sulfurique. Les résidus solides qui se trouvaient dans le mélange étaient extraits avec de l'eau, et révélaient la présence de chaux par addition d'ammoniaque. Les fumées combinées avec de l'eau formaient une masse blanche, identifiée comme de la silice. Ainsi, la solution obtenue présentait une réaction acide, que Carl Scheele nomma acide fluorhydrique (HF). Scheele réunit tous les résultats de ses expériences et montra comment identifier cet acide. Le fait que le fluor était capable de graver le verre permit à Jacob Berzelius d'en trouver dans de l'eau en 1822⁶.
Certains chercheurs contestèrent que l'acide fluorhydrique était vraiment un acide. C'est seulement après que l'acide chlorhydrique fut identifié comme un composé d'hydrogène, et la découverte d'un nouvel élément appelé chlore que certains chercheurs pensèrent que l'acide fluorhydrique était lui aussi un composé d'hydrogène, et d'un autre élément aux propriétés proches du chlore. Ils proposèrent de nommer cet élément inconnu fluor , puis phtor (du grec : « destructif »), en raison des propriétés destructives de ses composés. Ce terme de phtor ne fut accepté qu'en Grèce⁶.

Recherches sur l'isolement du fluor

Gay-Lussac et Thénard furent les premiers à tenter d'isoler le fluor. Leur préparation d'acide fluorhydrique fumait fortement dans l'air, dissolvait rapidement le verre, et causait de graves brûlures au contact de la peau. Ces expériences, et d'autres encores, avec des manipulations imprudentes, se soldaient souvent par des intoxications ou des morts⁶.
Antoine Lavoisier expérimenta aussi l’acide fluorhydrique (solution de fluorure d’hydrogène HF dans l’eau). Certaines de ces expériences menées pour isoler le fluor se terminèrent tragiquement, du fait du danger inhérent à cette substance⁷.
Humphry Davy chercha à montrer que l'acide fluorhydrique ne contenait pas d'oxygène. Il neutralisa l'acide avec de l'ammoniaque pur. La solution obtenue ne présentait pas d'eau, et donc pas d'oxygène. Ses expériences suivantes à partir d'électrolyses échouèrent. Puis il fit réagir le chlore avec des fluorures, sans plus de succès. Il en conclut que le fluor avait une activité chimique plus importante que les autres éléments⁸.
En 1833, Aimé mit en présence du fluorure d'argent (AgF) avec du chlore dans un vase de verre. Ces expériences ne furent pas plus satisfaisantes que celles de Davy. Les frères Knox répétèrent cet essai dans un appareil en fluorure de calcium (CaF₂). Mais il est très difficile de déshydrater le fluorure d'argent, et leur expérience échoua. En 1848, Louyet reprit des expériences analogues, en remplaçant le fluorure d'argent par du fluorure de mercure⁸. Aucunes de ces expériences ne permit d'isoler le fluor. Edmond Frémy démontra ensuite que l'action du chlore sur le fluor ne l'isole pas. Il démontra aussi l'existence de plusieurs fluorures.
En 1869, Georges Core produisit une petite quantité de fluor grâce à une électrolyse. Mais dans son expérience, du fluor gazeux et de l'hydrogène gazeux se formaient sur les deux électrodes, alors qu'il ne savait pas que le fluor et l'hydrogène gazeux se combinaient de manière explosive⁹.

Travaux de Moissan

Henri Moissan, premier chimiste à avoir isolé le fluor

Cet élément ne put être isolé pendant de nombreuses années, car, à peine séparé, il attaque immédiatement les restes de son composé. Mendeleïev l’a placé dans sa classification périodique en 1869, mais ce n’est que le 26 juin 1886 qu’Henri Moissan parvint à le préparer par électrolyse du fluorure de potassium dans du fluorure d’hydrogène, avec des électrodes en platine iridié, sous une tension de 50 volts. L'ensemble de l'expérience était menée dans un tube en U en platine bouché par des capuchons en fluorine¹⁰. Le difluor pur apparaissait à l'anode et le dihydrogène à la cathode. Henri Moissan dut mener cette expérience à basse température, car le fluorure d’hydrogène (HF) bout à 19 °C⁸. Cette découverte, rapportée à l'Académie des sciences deux jours plus tard, lui valut le prix Nobel de Chimie en 1906¹¹. Elle fut l'occasion de l'élaboration d'un instrument révolutionnaire : le four électrique. Moissan réussit là où des chimistes parmi les plus grands avaient échoué : H. Davy (1813-14), G. Aimé (1833), M. Faraday (1834), C.J. et T Knox (1836), P. Louyet (1846), E. Frémy (1854), H. Kammerer (1862) et G. Gore (1870).

Propriétés physiques

Le fluor est le premier élément de la colonne des halogènes. C'est un gaz jaune verdâtre d'une odeur piquante et irritante¹², toxique, non combustible mais capable d'oxyder (comburant) dangereusement vite tout ce qui peut brûler dans l'air et même l'eau, le verre ou le sable ordinaires réagissent dans une atmosphère de fluor. C'est un élément très actif chimiquement, rarement monoatomique.
Un atome de fluor possède 9 électrons qui gravitent autour du noyau, sa configuration électronique peut s'écrire 1s² 2s² 2p⁵ ou [He](2s)²(2p)⁵. Sa structure électronique s'écrit (K)²(L)⁷. Pour que le fluor respecte la règle de l'octet, il gagne un dixième électron en formant l'ion fluorure F^- pour avoir 8 électrons sur sa couche externe.
La première densité du fluor a été calculée par Henri Moissan à partir d'une expérience où il a recueilli du fluor et de l'air dans un flacon de platine. Henri Moissan a obtenu une densité de 1,264 à 0 °C et 760 mmHg. Il a ensuite calculé la densité théorique en multipliant la densité de l'hydrogène et le poids atomique du fluor, il a trouvé 1,316¹³.

Isotopes

Article détaillé : Isotopes du fluor.

Le fluor possède en tout dix-huit isotopes¹⁴ mais seul le fluor 19 (¹⁹F) est stable, faisant du fluor un élément monoisotopique. Les autres isotopes les plus stables sont le fluor 18 (¹⁸F) d'une demi-vie de 1,8293 h soit environ 110 min¹⁵ et le fluor 20 (²⁰F) d'une demi-vie de 11,163 s. Sur Terre, il n'y aucun fluor 18 naturel car aucun processus naturel ne conduit à sa formation et donc l'abondance du fluor 19 est de 100 %, faisant du fluor également un élément mononucléidique ; ¹⁹F étant le seul isotope naturel, cela permet de connaître sa masse molaire avec une très grande précision¹⁶. Tous ses isotopes non stables se transforment en isotopes de l'oxygène ou en isotopes du néon¹⁷.
L'isotope le plus abondant, le fluor 19 provient de la nucléosynthèse stellaire (Cycle CNO III ou IV).

Il est parfois produit sur Terre par désintégration bêta de l'oxygène 19¹⁸ (¹⁹O) ou par capture électronique du néon 19¹⁹ (¹⁹Ne). Dans le cas de la capture électronique, un proton du néon capture un électron ce qui le transforme en neutron. Dans le cas de la désintégration β^-, un neutron de l'atome d'oxygène est converti en proton :

Le fluor 19 possède 19 nucléons dont 10 neutrons et 9 protons, atome de masse atomique de 18,9984032 g/mol. Il est caractérisé par un excès de masse de -1 487,405±0,070 keV/c² et une énergie de liaison nucléaire de 147 801 358±74 eV²⁰.
On peut fabriquer d'autres isotopes par réactions nucléaires, instables, qui se désintègrent rapidement, peu dépassent la minute. L'isotope ayant la demi-vie la plus courte est le fluor 16, qui se désintègre par émission d'un proton en 40 keV. Le fluor 17 se désintègre par capture électronique en 64,49 s. Le fluor 20, fluor 21, fluor 22, fluor 23, fluor 24 et fluor 25 se désintègrent par désintégration β^- en 11 s, 4,158 s, 4,23 s, 2,23 s, 0,34 s et 0,059 s, respectivement¹⁷.
Le fluor 18 est le radioisotope le plus stable qui puisse être fabriqué. Sa demi-vie est approximativement de 110 min. Cet atome compte 9 protons et 9 neutrons pour une masse atomique de 18,0009377 g/mol. Il est caractérisé par un excès de masse de 873 431±593 eV/c² et une énergie de liaison nucléaire de 137 369 199±593 eV²¹.

Spectre

Au XIX^e siècle, peu de temps avant l'isolation de l'élément, le savant Georges Salet a déterminé quelques raies du fluor en comparant les spectres d'émission du chlorure et du fluorure de silicium. Les Fα présentent des raies à 692, 686 et 678 nm environ chacune. Les Fβ présentent une raie à 640 nm et les Fγ à 623 nm. Henri Moissan a repris les expériences de Salet et a utilisé des électrodes de platine puis des électrodes d'or. Il a pu comparer le spectre de Salet avec ceux fournis par certains fluorures. Avec les électrodes de platine, on obtient plusieurs raies de longueur d'onde 744, 740, 734, 714, 704, 691, 687,5, 685,5, 683,5, 677, 640,5, 634 et 623 nm alors que les électrodes d'or ne permettent pas d'avoir les longueurs d'onde 744 et 740 nm²².

Combustion

Le fluor est un gaz ininflammable mais qui peut produire une flamme en réagissant avec de nombreuses substances chimiques. Il peut réagir violemment avec un grand nombre de composés chimiques et avec l'eau, même à basse température, et forme de l'ozone et de l'acide fluorhydrique²³.

3F₂ + 3H₂O → O₃ + 6HF

Gaz

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Plasma

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Liquide

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Superfluide

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Solide

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Composés

Le difluor pur est un gaz jaune pâle corrosif : c’est un oxydant puissant. Elément le plus réactif et le plus électronégatif, il forme des composés avec la plupart des autres éléments, y compris les gaz rares xénon et radon avec lesquels il réagit directement.
Même dans des conditions de basse température et sans lumière, le difluor réagit explosivement avec le dihydrogène, même en dessous de -250 °C lorsque le fluor est solide et l’hydrogène liquide. Dans un jet de gaz difluor, le verre, les métaux, l’eau et d’autres substances brûlent avec une flamme lumineuse. Le fluor a une telle affinité pour la plupart des éléments, en particulier pour le silicium (Si), qu’il ne peut ni être préparé ni être conservé dans des récipients de verre (constitués principalement de silice SiO₂). Il est en conséquence manipulé dans le téflon, un polymère appelé KelF ou dans les récipients en nickel. Dans ce dernier cas, la surface du récipient est initialement (et une fois pour toute) passivée par un premier contact avec le difluor.

Minéraux

Parmi ceux-ci, la fluorine est un fluorure de calcium de composition CaF₂.

• Fluorite
• Fluorapatite
• Cryolite

Préparation

Le difluor, F₂, est aujourd’hui encore produit industriellement grâce au procédé d’électrolyse introduit par Henri Moissan en 1886. Le bain électrolytique est constitué d’un mélange KF-2HF fondu à 90 °C - 100 °C environ. Le HF anhydre n’est pas conducteur car peu dissocié et c’est l’ajout de KHF₂ qui permet la conduction ionique par un mécanisme complexe.
Lors de la réaction d’électrolyse, le difluor est produit sur une anode en carbone selon :
2 HF₂^- → F₂(g) + 2 HF + 2 e^-
A la cathode (en métal), du dihydrogène est produit :
4 HF + 2 e^- → H₂(g) + 2 HF₂^-
Dans la cellule d’électrolyse, le potentiel appliqué est compris entre 8 et 10 V, et la densité de courant est de l’ordre de 12 A⋅dm^-2. Le rendement en courant est bon (95 %), mais le rendement énergétique global n’est que de 30 %.
En 1986, à l’occasion du centième anniversaire de la découverte de la préparation électrochimique du fluor, Karl Christe a découvert une méthode originale et purement chimique de préparation en faisant réagir à 150 °C de l’acide fluorhydrique anhydre HF avec K₂MnF₆ et SbF₅. La réaction est :
K₂MnF₆ + 2 SbF₅ → 2 KSbF₆ + MnF₃ + 1/2 F₂
Ce procédé est anecdotique car inexploitable industriellement.

Utilisation

Le difluor est trop réactif pour une utilisation directe à l’état pur. Ses nombreux composés chimiques ont par contre une multitude d’applications. Quelques exemples :

• Le fluor entre dans la composition de matières plastiques à faible coefficient de friction ; les fluoropolymères tel le PTFE (polytétrafluoroéthylène) commercialement connu entre autres sous la marque Teflon® ;
• Le fluor entre aussi dans la composition des tensioactifs fluorés ;
• De nombreux gaz fluorés, comme par exemple les fréons, sont utilisés en tant que fluide frigorigène dans les systèmes de réfrigération et d’air conditionné. Les chlorofluorocarbures (CFC) ont cependant été bannis de ces applications à cause de leur contribution probable au trou de la couche d’ozone et à l'effet de serre ;
• L'acide fluorhydrique (HF) a la propriété unique de pouvoir dissoudre presque tous les oxydes inorganiques. Il est de fait utilisé pour attaquer le verre, pour éliminer les oxydes de surface du silicium dans l'industrie des semi-conducteurs, comme catalyseur des réactions d’alkylation de l'isobutane et du butène dans le raffinage du pétrole et pour éliminer des impuretés oxydées de l’acier inoxydable ;
• Dans le cycle du combustible nucléaire, l’hexafluorure d’uranium UF₆ est utilisé pour séparer les différents isotopes de l’uranium par diffusion gazeuse. Il est produit dans un four à flamme par réaction chimique du difluor avec le tétrafluorure d’uranium UF₄. Dans ce cadre, le difluor a été utilisé lors de l'élaboration de la bombe atomique, à l'occasion du Projet Manhattan ;
• La cryolithe, un minéral composé de fluorure de sodium et d’aluminium (Na₃AlF₆), est utilisée comme électrolyte dans la production d’aluminium par électrolyse ;
• Le fluor monoatomique est utilisé pour le « plasma ashing » dans la fabrication des semi-conducteurs ;
• Avec d’autres composés, le fluor est utilisé dans la fabrication de plus d’une centaine de composés fluorés commerciaux, tel que le plastique haute température ;
• L’isotope radioactif F du fluor, émetteur de positrons, est le noyau le plus utilisé dans la technique de tomographie par émission de positrons (TEP – une nouvelle technique de visualisation médicale non invasive) de par sa demi-vie de 110 minutes, relativement longue ;
• Le fluorure de sodium a été utilisé comme insecticide, particulièrement contre les cafards ou comme dératiseur ;
• Des fluorures sont ajoutés au sel (42 % du sel vendu aux ménages français est iodé et fluoré²⁴) et aux dentifrices, ou parfois dans certaines sources d’eau ou dans certains aliments pour lutter contre les caries dentaires. Cette utilisation est contestée par différentes associations et groupes de pressions de consommateurs dans le monde²⁵.
• Arme chimique : les gaz sarin (classifié comme arme de destruction massive par la résolution 687 du Conseil de sécurité des Nations unies; et de triste mémoire utilisé le 20 mars 1995 à Tokyo) et soman pour ne citer qu'eux...
• Médicament : Prozac®, etc...

La première production industrielle de difluor eut lieu lors de la fabrication de la bombe atomique, dans le cadre du projet Manhattan lors de la Seconde Guerre mondiale⁷, où l’hexafluorure d'uranium UF₆, qui est un composé moléculaire volatil, était utilisé pour séparer les différents isotopes de l’uranium par diffusion gazeuse. Ce procédé est d’ailleurs toujours mis en œuvre lors de la fabrication du combustible nucléaire utilisé dans les centrales nucléaires actuelles.

Toxicité

Le fluor est toxique pour l’homme :

• < 0,05 mg/kg/jour : n'est d'aucun effet sur la prévention de la carie dentaire ²⁶ , ²⁷ ;
• 2 mg/jour : risque de fluorose dentaire ;
• 10 à 40 mg/jour : fluorose du squelette ;
• 20 à 80 mg/jour : fluorose ankylosante ;
• 100 mg/jour : retard de croissance ;
• 125 mg/jour : altération rénale ;
• 200 à 500 mg/jour : dose létale.

Des enfants ayant avalé leur dentifrice en se brossant les dents pendant une longue période ou qui ont mangé du dentifrice présentent parfois des intoxications au fluor ; d’où l’intérêt de bien expliquer aux enfants qu’ils doivent recracher le dentifrice et pourquoi ils doivent le faire.
L'Organisation mondiale de la santé, dans un rapport de novembre 2006, et d'autres ²⁸ attirent l'attention sur les dangers des doses excessives de fluor dans l'alimentation et explique comment fabriquer et utiliser des filtres permettant de neutraliser le fluor dans l'eau de boisson²⁹.
L'utilisation de fluor dans les camps de concentration a été rapportée par Joseph Borkin dans son livre The Crime and Punishment of I.G. Farben : « La Gestapo avait peu de soucis de l’état de la denture des enfants… leurs scientifiques avaient trouvé que le fluor pouvait rendre stérile et qu’il générait une calme soumission. »
Depuis, l'association entre le déclin du quotient intellectuel et les concentrations de fluor dans l'eau a été confirmée³⁰. En 2007, la revue Environmental Health Perspectives publiait une mini-monographie soulignant, d'une part, l'absence de recherches en anglais sur l'impact du fluor sur l'intelligence et, d'autre part, le développement de la recherche sur le sujet dans la communauté scientifique chinoise, depuis 1998, pour conclure que le fluor dans l'eau était corrélé avec le déclin de l'intelligence (quotient intellectuel). La relation dose-effet n'a cependant pas été établie dans cette étude³¹.

Règlementation

Diverses normes et règlements existent, selon les pays et les usages de certains produits.
En France : La fluoration de l’eau est autorisée sous forme d'hexafluorosilicate de sodium³² et d'acide hexafluorosilicique³³, cependant peu d'informations sont disponibles sur son utilisation réelle dans la production d'eau du robinet. En revanche la fluoration du sel est autorisée et encouragée. Celui-ci doit alors être étiqueté sel fluoré ou sel iodé et fluoré, ce qui signifie qu’il est supplémenté en fluor à raison de 250 mg/kg sous la forme de fluorure de potassium (par voie humide). Cette fluoration a été encouragée en 1985 par la Direction Générale de la Santé pour la prévention en masse des caries dans la population. Les emballages doivent alors aussi alerter le consommateur par la mention : « ne pas consommer si l’eau de boisson contient plus de 0,5 mg/litre de fluor ». Une réglementation impose depuis 1993 l’usage de sel fluoré dans les cantines scolaires.

Notes et références

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2. ↑ Base de données Chemical Abstracts interrogée via SciFinder Web le 15 décembre 2009 (résultats de la recherche)
3. ↑ (en) Beatriz Cordero, Verónica Gómez, Ana E. Platero-Prats, Marc Revés, Jorge Echeverría, Eduard Cremades, Flavia Barragán et Santiago Alvarez, « Covalent radii revisited », Dalton Transactions, 2008, p. 2832 - 2838 [lien DOI [archive]]
4. ↑ Paul Arnaud, Brigitte Jamart, Jacques Bodiguel, Nicolas Brosse, Chimie Organique 1^er cycle/Licence, PCEM, Pharmacie, Cours, QCM et applications, Dunod, 8 juillet 2004, Broché, 710 p. (ISBN 2100070355)
5. ↑ (en) David R. Lide, CRC Handbook of Chemistry and Physics, TF-CRC, 2006, 87^e éd. (ISBN 0849304873), p. 10-202
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12. ↑ (fr) Le fluor [archive], sur periodni. Consulté le 20 mars 2010
13. ↑ Henri Moissan, Le fluor et ses composés, A.-G. Lemale, 1900, « Densité du fluor »
14. ↑ (en) Les termes en F [archive], sur iaea : International Atomic Energy Agency. Consulté le 20 mars 2010
15. ↑ (fr) 18F [archive], sur www-dsv.cea. Consulté le 19 mars 2010
16. ↑ (fr) Isotopes naturels du fluor [archive], sur ktf-split. Consulté le 20 mars 2010
17. ↑ ^{a et b} (en) Isotopes du fluor [archive], sur environmentalchemistry. Consulté le 20 mars 2010
18. ↑ (en) Isotopes de l'oxygène [archive], sur environmentalchemistry. Consulté le 20 mars 2010
19. ↑ (en) Isotopes du néon [archive], sur environmentalchemistry. Consulté le 20 mars 2010
20. ↑ (en) « Le fluor 19 » ^{(Archive • Wikiwix • Que faire ?)}. Consulté le 2013-03-26
21. ↑ (en) « Le fluor 18 » ^{(Archive • Wikiwix • Que faire ?)}. Consulté le 2013-03-26
22. ↑ Henri Moissan, Le fluor et ses composés, A.-G. Lemale, 1900, « Spectre du fluor »
23. ↑ (en) Pradyot Patnaik, A comprehensive guide to the hazardous properties of chemical substances, 2007 [lire en ligne [archive] (page consultée le 26 mars 2010)], « Halogens, Halogens Oxides, and Interhalogen Compounds », p. 472
24. ↑ (fr) Comité des Salines de France, « Page sur le Fluor » [archive], sur site du Comité des Salines de France. Consulté le 15 mars 2010
25. ↑ (fr) Un front citoyen contre la fluoration de l’eau [archive], sur actualites-news-environnement. Consulté le 15 mars 2010
26. ↑ (fr) Les enjeux du Fluor [archive]. Consulté le 20 janvier 2013
27. ↑ (en) Paul & Patricia Bragg : Water the Shocking Truth, Healthy Science, Santa Barbara, California, pp. 15-26, ISBN: 0-87790-065-5
28. ↑ Université De Sherbrooke (2012) Problématique écotoxicologique actualisée des fluorures dans les eaux municipales [archive] (Mémoire en ligne), 21/01/2012
29. ↑ (en) Fluoride drinking water - rapport de l' [archive]OMS, sur who.int, 2006. Consulté le 19 mars 2010
30. ↑ Intelligence quotient of 7 to 9 year-old children from an area with high fluoride in drinking water [archive] ; Journal of Dentistry and Oral Hygiene Vol. 3(4), pp. 61-64, April 2011
31. ↑ SX. Wang, ZH. Wang, XT. Cheng, J. Li, ZP. Sang, XD. Zhang, LL. Han, XY. Qiao et ZM. Wu, « Arsenic and fluoride exposure in drinking water: children's IQ and growth in Shanyin county, Shanxi province, China. », Environ Health Perspect, vol. 115, n^o 4, avril 2007, p. 643-7 [lien DOI [archive]]
32. ↑ (fr) NF EN 12174 [archive], sur afnor.org, 2006. Consulté le 5 novembre 2010
33. ↑ (fr) NF EN 12175 [archive], sur afnor.org, 2006. Consulté le 5 novembre 2010

Compléments

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• fluor, sur le Wiktionnaire

Bibliographie

• Henri Moissan, Extrait des Annales de chimie et de physique : Recherches sur l'isolement du fluor, vol. série 6, t. XII, Gauthier-Villars, 1887
• Henri Moissan, Le fluor et ses composés, G. Steinheil, 1900

Liens externes

• (en) History of fluorine, fluoride, and fluoridation
• (en) Images du fluor sous différentes formes
• (en)/(fr) Environmental Health Criteria for Fluorides (EHC 227) publié en 2002 par l’OMS (Résumé et conclusions en français)
• (fr) Effets sur la santé des fluorures - un résumé pour non-spécialistes du rapport de l’OMS par GreenFacts
• (fr) « Presse libre internationale » ^{(Archive • Wikiwix • Que faire ?)}. Consulté le 2013-03-26 (Site internet québécois très complet d'information sur le fluor et d'alerte sur ses dangers)